氨基酸(amino acid, AA)含量測定試劑盒說明書

微量法 100T/96S

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

動物肝臟、腎臟是氨基酸代謝的主要器官，故尿中氨基酸的變化最能反應(yīng)肝、腎的生理狀態(tài)。另外，氨基酸還能反應(yīng)灼傷、傷寒等方面情況。植物體內(nèi)氨基酸含量對研究植物在不同條件下及不同生長發(fā)育時期氮代謝變化、植物對氮素的吸收、運輸、同化及營養(yǎng)狀況等有重要意義。

測定原理：

氨基酸的α -氨基可與水合茚三酮反應(yīng)，產(chǎn)生藍紫色化合物，在 570 nm 有特征吸收峰；通過測定 570 nm

吸光度，來計算氨基酸含量。

組成：

試劑三臨用前加入 667μl 無水乙醇，蓋緊后充分混勻，再加入 9.333ml 蒸餾水混勻，避光保存。試劑四臨用前加 1ml 蒸餾水，充分溶解。

標(biāo)準品臨用前加 10ml 蒸餾水，充分溶解。1μmol/mL 標(biāo)準液，4℃避光保存。

自備儀器和用品：

臺式離心機、水浴鍋、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、無水乙醇、冰和蒸餾水。

樣品中 AA 提取：

1、按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行室溫勻漿，然后轉(zhuǎn)移到 1.5ml EP 管中，蓋緊后（防止水分散失）置于沸水浴提取 15 min；自來水冷卻后，8000g，，4℃離心 10min，上清液置冰上待測。

2、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 試劑一），超聲波破碎細菌

或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清等液體：直接檢測。

測定步驟：

1.   分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 570 nm，蒸餾水調(diào)零。

2.   空白管：取EP 管，加入 10μl 蒸餾水，100μl 試劑二，100μl 試劑三和 10μl 試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫 15 min，冷卻后反復(fù)顛倒EP 管數(shù)次，于 570nm 測定吸光值，記為A 空白管。顯色后務(wù)必在 30min 內(nèi)測完。

3.   標(biāo)準管：取EP 管，加入 10μl 標(biāo)準品，100μl 試劑二，100μl 試劑三和 10μl 試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫 15 min，冷卻后反復(fù)顛倒EP 管數(shù)次，于 570nm 測定吸光值，記為A 標(biāo)準管。顯色后務(wù)必在 30min 內(nèi)測完。

4.   測定管：取EP 管，加入 10μl 上清液，100μl 試劑二，100μl 試劑三和 10μl 試劑四，混勻后蓋緊瓶蓋（防止水分散失），置于沸水浴中保溫 15 min，冷卻后反復(fù)顛倒EP 管數(shù)次，于 570nm 測定吸光值，記為A 測定管。顯色后務(wù)必在 30min 內(nèi)測完。

注意：空白管和標(biāo)準管只需要測定一次。

氨基酸含量計算公式：

a.  使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

氨基酸含量（μmol /mg prot）= [C 標(biāo)準品×V 標(biāo)準品×(A 測定－A 空白)÷(A 標(biāo)準－A 空白)]÷（V 樣×Cpr）

=1×(A 測定－A 空白)÷(A 標(biāo)準－A 空白) ÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計算

氨基酸含量（μmol /g 鮮重）=[C 標(biāo)準品×V 標(biāo)準品×(A 測定－A 空白)÷(A 標(biāo)準－A 空白)] ÷（V 樣總

÷V 樣）÷W

=1×(A 測定－A 空白)÷(A 標(biāo)準－A 空白) ÷W

（3） 按細胞數(shù)量計算

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C 標(biāo)準品×V 標(biāo)準品×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準管－A 空白管)] ×

（V 樣總÷V 樣×細胞數(shù)量）

=1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準管－A 空白管) ÷細胞數(shù)量

（4） 按照液體體積計算

氨基酸含量（μmol /mL）=[C 標(biāo)準品×V 標(biāo)準品×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準管－A 空白管)]÷V 樣

=1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準管－A 空白管)

C 標(biāo)準品：標(biāo)準品濃度，1 μmol/mL；V 標(biāo)準品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準品體積，0.01ml；W：樣品質(zhì)量， g；V 樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積，0.01ml；V 樣總：樣品提取液總體積，1mL；；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

b.  使用 96 孔板測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

氨基酸含量（μmol /mg prot）=[C 標(biāo)準品×V 標(biāo)準品×(A 測定－A 空白)÷(A 標(biāo)準－A 空白)] ÷（V 樣×Cpr）

=1×(A 測定－A 空白)÷(A 標(biāo)準－A 空白) ÷Cpr

（2） 按樣本質(zhì)量計算

氨基酸含量（μmol /g 鮮重）=[C 標(biāo)準品×V 標(biāo)準品×(A 測定－A 空白)÷(A 標(biāo)準－A 空白)]×（V 樣總÷V樣）÷W

=1×(A 測定－A 空白)÷(A 標(biāo)準－A 空白) ÷W

（3） 按細胞數(shù)量計算

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）= [C 標(biāo)準品×V 標(biāo)準品×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準管－A 空白管)] ×

（V 樣總÷V 樣×細胞數(shù)量）

=1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準管－A 空白管) ÷細胞數(shù)量

（4） 按照液體體積計算

氨基酸含量（μmol /mL）=[C 標(biāo)準品×V 標(biāo)準品×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準管－A 空白管)]÷V 樣

=1×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準管－A 空白管)

C 標(biāo)準品：標(biāo)準品濃度，1 μmol/mL；V 標(biāo)準品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準品體積，0.01ml；W：樣品質(zhì)量， g；V 樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積，0.01mL；V 樣總：樣品提取液總體積，1mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

注意事項：

1.     試劑盒中試劑三、試劑四和標(biāo)準品均需臨用前配制，且避光保存，配制好未使用完的 4℃保存且 3

天內(nèi)使用完畢。

2.     為保證實驗結(jié)果的準確性，需先取 1-2 個樣做預(yù)實驗，如果測定的吸光值過高（高于 2.5），用蒸餾水稀釋后再測定。

3.     脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)在 570nm 處無吸收峰，因此，570nm 處測定結(jié)果不含這兩種氨基酸的量。

4. 最di檢出限為 100μmol/L。